Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain
Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija mutanata celobioza - dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium u Pichia pastoris KM71H soju
Autori
Balaž, Ana MarijaBlažić, Marija
Popović, Nikolina
Prodanović, Olivera
Ostafe, Raluca
Fischer, Rainer
Prodanović, Radivoje
Članak u časopisu (Objavljena verzija)
Metapodaci
Prikaz svih podataka o dokumentuApstrakt
Production of soluble cellobiose dehydrogenase (CDH) mutant proteins previously evolved on the surface of S. cerevisiae yeast cells was established for use in biosensors and biofuel cells. For this purpose, mutant cdh genes tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) and H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) were cloned to pPICZα plasmid and transformed into Pichia pastoris KM71H strain for high expression in a soluble form and kinetic characterization. After 6 days of expression under methanol induction, the CDHs were purified by ultrafiltration, ion- -exchange chromatography and gel filtration. Sodium dodecyl sulfate electrophoresis confirmed the purity and presence of a single protein band at a molecular weight of 100 kDa. Kinetic characterization showed that the H5 mutant had the highest catalytic constant of 43.5 s-1 for lactose, while the mutant H9 showed the highest specificity constant for lactose of 132 mM-1 s-1. All three mutant proteins did not change th...e pH optimum that was between 4.5 and 5.5. Compared to the previously obtained wild types and mutants of CDH from Phanerochaete chrysosporium, the variants reported in this article had higher activity and specificity that together with high protein expression rate in P. pastoris, makes them good candidates for use in biotechnology for lactobionic acid production and biosensor manufacture.
У циљу употребе у биосензорима и биогоривним ћелијама, успостављена је производња
растворних облика целобиоза дехидрогеназе (CDH) претходно еволуираних на површини
квашчевих ћелија S. cerevisiae. У ту сврху су мутанти CDH, tm (D20N, A64T, V592M), H5
(D20N, V22A, A64T, V592M) и H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S)
клонирани у pPICZα плазмид и трансформисани у Pichia pastoris KM71H сој за високу
експресију у растворном облику и кинетичку карактеризацију. После 6 дана експресије под
индукцијом метанолом, мутанти су пречишћени ултрафилтрацијом, јоноизмењивачком
хроматографијом и гел-филтрацијом. SDS електрофореза је потврдила чистоћу уз присуство
једне протеинске траке молекулскe масe од 100 kDa. Кинетичка карактеризација је показала
да H5 мутирани протеин поседује највећу каталитичку константу од 43,5 s-1 за лактозу, док
је H9 имао највећу константу специфичности за лактозу од 132 mM-1 s-1. Сва три мутирана
протеина су имала неизмењен pH оптимум који је био у опсег...у од 4,5 до 5,5. У поређењу са
претходно добијеним природним и мутантним облицима CDH протеина из Phanerochaete
chrysosporium, облици приказани у овом раду имају већу активност и специфичност, што их,
повезано са високом експресијом протеина у P. Pastoris, чини добрим кандидатима за упо-
требу у биотехнологији за производњу лактобионске киселине и биосензора.
Ključne reči:
mutant proteins / yeast / protein purification / kinetic characterisationIzvor:
Journal of the Serbian Chemical Society, 2020, 85, 1, 25-35Izdavač:
- Belgrade : Serbian Chemical Society
Finansiranje / projekti:
- Alergeni, antitela, enzimi i mali fiziološki značajni molekuli: dizajn, struktura, funkcija i značaj (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-172049)
- Ispitivanja odnosa struktura-funkcija u ćelijskom zidu biljaka i izmene strukture zida enzimskim inženjeringom (RS-MESTD-Basic Research (BR or ON)-173017)
- Razvoj novih inkapsulacionih i enzimskih tehnologija za proizvodnju biokatalizatora i biološki aktivnih komponenata hrane u cilju povećanja njene konkurentnosti, kvaliteta i bezbednosti (RS-MESTD-Integrated and Interdisciplinary Research (IIR or III)-46010)
DOI: 10.2298/JSC190320058B
ISSN: 0352-5139; 1820-7421
WoS: 000514217400003
Scopus: 2-s2.0-85094195269
Institucija/grupa
IHTMTY - JOUR AU - Balaž, Ana Marija AU - Blažić, Marija AU - Popović, Nikolina AU - Prodanović, Olivera AU - Ostafe, Raluca AU - Fischer, Rainer AU - Prodanović, Radivoje PY - 2020 UR - https://cer.ihtm.bg.ac.rs/handle/123456789/3880 AB - Production of soluble cellobiose dehydrogenase (CDH) mutant proteins previously evolved on the surface of S. cerevisiae yeast cells was established for use in biosensors and biofuel cells. For this purpose, mutant cdh genes tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) and H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) were cloned to pPICZα plasmid and transformed into Pichia pastoris KM71H strain for high expression in a soluble form and kinetic characterization. After 6 days of expression under methanol induction, the CDHs were purified by ultrafiltration, ion- -exchange chromatography and gel filtration. Sodium dodecyl sulfate electrophoresis confirmed the purity and presence of a single protein band at a molecular weight of 100 kDa. Kinetic characterization showed that the H5 mutant had the highest catalytic constant of 43.5 s-1 for lactose, while the mutant H9 showed the highest specificity constant for lactose of 132 mM-1 s-1. All three mutant proteins did not change the pH optimum that was between 4.5 and 5.5. Compared to the previously obtained wild types and mutants of CDH from Phanerochaete chrysosporium, the variants reported in this article had higher activity and specificity that together with high protein expression rate in P. pastoris, makes them good candidates for use in biotechnology for lactobionic acid production and biosensor manufacture. AB - У циљу употребе у биосензорима и биогоривним ћелијама, успостављена је производња растворних облика целобиоза дехидрогеназе (CDH) претходно еволуираних на површини квашчевих ћелија S. cerevisiae. У ту сврху су мутанти CDH, tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) и H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) клонирани у pPICZα плазмид и трансформисани у Pichia pastoris KM71H сој за високу експресију у растворном облику и кинетичку карактеризацију. После 6 дана експресије под индукцијом метанолом, мутанти су пречишћени ултрафилтрацијом, јоноизмењивачком хроматографијом и гел-филтрацијом. SDS електрофореза је потврдила чистоћу уз присуство једне протеинске траке молекулскe масe од 100 kDa. Кинетичка карактеризација је показала да H5 мутирани протеин поседује највећу каталитичку константу од 43,5 s-1 за лактозу, док је H9 имао највећу константу специфичности за лактозу од 132 mM-1 s-1. Сва три мутирана протеина су имала неизмењен pH оптимум који је био у опсегу од 4,5 до 5,5. У поређењу са претходно добијеним природним и мутантним облицима CDH протеина из Phanerochaete chrysosporium, облици приказани у овом раду имају већу активност и специфичност, што их, повезано са високом експресијом протеина у P. Pastoris, чини добрим кандидатима за упо- требу у биотехнологији за производњу лактобионске киселине и биосензора. PB - Belgrade : Serbian Chemical Society T2 - Journal of the Serbian Chemical Society T1 - Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain T1 - Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija mutanata celobioza - dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium u Pichia pastoris KM71H soju VL - 85 IS - 1 SP - 25 EP - 35 DO - 10.2298/JSC190320058B ER -
@article{ author = "Balaž, Ana Marija and Blažić, Marija and Popović, Nikolina and Prodanović, Olivera and Ostafe, Raluca and Fischer, Rainer and Prodanović, Radivoje", year = "2020", abstract = "Production of soluble cellobiose dehydrogenase (CDH) mutant proteins previously evolved on the surface of S. cerevisiae yeast cells was established for use in biosensors and biofuel cells. For this purpose, mutant cdh genes tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) and H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) were cloned to pPICZα plasmid and transformed into Pichia pastoris KM71H strain for high expression in a soluble form and kinetic characterization. After 6 days of expression under methanol induction, the CDHs were purified by ultrafiltration, ion- -exchange chromatography and gel filtration. Sodium dodecyl sulfate electrophoresis confirmed the purity and presence of a single protein band at a molecular weight of 100 kDa. Kinetic characterization showed that the H5 mutant had the highest catalytic constant of 43.5 s-1 for lactose, while the mutant H9 showed the highest specificity constant for lactose of 132 mM-1 s-1. All three mutant proteins did not change the pH optimum that was between 4.5 and 5.5. Compared to the previously obtained wild types and mutants of CDH from Phanerochaete chrysosporium, the variants reported in this article had higher activity and specificity that together with high protein expression rate in P. pastoris, makes them good candidates for use in biotechnology for lactobionic acid production and biosensor manufacture., У циљу употребе у биосензорима и биогоривним ћелијама, успостављена је производња растворних облика целобиоза дехидрогеназе (CDH) претходно еволуираних на површини квашчевих ћелија S. cerevisiae. У ту сврху су мутанти CDH, tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) и H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) клонирани у pPICZα плазмид и трансформисани у Pichia pastoris KM71H сој за високу експресију у растворном облику и кинетичку карактеризацију. После 6 дана експресије под индукцијом метанолом, мутанти су пречишћени ултрафилтрацијом, јоноизмењивачком хроматографијом и гел-филтрацијом. SDS електрофореза је потврдила чистоћу уз присуство једне протеинске траке молекулскe масe од 100 kDa. Кинетичка карактеризација је показала да H5 мутирани протеин поседује највећу каталитичку константу од 43,5 s-1 за лактозу, док је H9 имао највећу константу специфичности за лактозу од 132 mM-1 s-1. Сва три мутирана протеина су имала неизмењен pH оптимум који је био у опсегу од 4,5 до 5,5. У поређењу са претходно добијеним природним и мутантним облицима CDH протеина из Phanerochaete chrysosporium, облици приказани у овом раду имају већу активност и специфичност, што их, повезано са високом експресијом протеина у P. Pastoris, чини добрим кандидатима за упо- требу у биотехнологији за производњу лактобионске киселине и биосензора.", publisher = "Belgrade : Serbian Chemical Society", journal = "Journal of the Serbian Chemical Society", title = "Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain, Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija mutanata celobioza - dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium u Pichia pastoris KM71H soju", volume = "85", number = "1", pages = "25-35", doi = "10.2298/JSC190320058B" }
Balaž, A. M., Blažić, M., Popović, N., Prodanović, O., Ostafe, R., Fischer, R.,& Prodanović, R.. (2020). Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain. in Journal of the Serbian Chemical Society Belgrade : Serbian Chemical Society., 85(1), 25-35. https://doi.org/10.2298/JSC190320058B
Balaž AM, Blažić M, Popović N, Prodanović O, Ostafe R, Fischer R, Prodanović R. Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain. in Journal of the Serbian Chemical Society. 2020;85(1):25-35. doi:10.2298/JSC190320058B .
Balaž, Ana Marija, Blažić, Marija, Popović, Nikolina, Prodanović, Olivera, Ostafe, Raluca, Fischer, Rainer, Prodanović, Radivoje, "Expression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strain" in Journal of the Serbian Chemical Society, 85, no. 1 (2020):25-35, https://doi.org/10.2298/JSC190320058B . .