Show simple item record

Ekspresija, prečišćavanje i karakterizacija mutanata celobioza - dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium u Pichia pastoris KM71H soju

dc.creatorBalaž, Ana Marija
dc.creatorBlažić, Marija
dc.creatorPopović, Nikolina
dc.creatorProdanović, Olivera
dc.creatorOstafe, Raluca
dc.creatorFischer, Rainer
dc.creatorProdanović, Radivoje
dc.date.accessioned2020-11-29T09:29:31Z
dc.date.available2020-11-29T09:29:31Z
dc.date.issued2020
dc.identifier.issn0352-5139
dc.identifier.issn1820-7421
dc.identifier.urihttps://cer.ihtm.bg.ac.rs/handle/123456789/3880
dc.description.abstractProduction of soluble cellobiose dehydrogenase (CDH) mutant proteins previously evolved on the surface of S. cerevisiae yeast cells was established for use in biosensors and biofuel cells. For this purpose, mutant cdh genes tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) and H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) were cloned to pPICZα plasmid and transformed into Pichia pastoris KM71H strain for high expression in a soluble form and kinetic characterization. After 6 days of expression under methanol induction, the CDHs were purified by ultrafiltration, ion- -exchange chromatography and gel filtration. Sodium dodecyl sulfate electrophoresis confirmed the purity and presence of a single protein band at a molecular weight of 100 kDa. Kinetic characterization showed that the H5 mutant had the highest catalytic constant of 43.5 s-1 for lactose, while the mutant H9 showed the highest specificity constant for lactose of 132 mM-1 s-1. All three mutant proteins did not change the pH optimum that was between 4.5 and 5.5. Compared to the previously obtained wild types and mutants of CDH from Phanerochaete chrysosporium, the variants reported in this article had higher activity and specificity that together with high protein expression rate in P. pastoris, makes them good candidates for use in biotechnology for lactobionic acid production and biosensor manufacture.en
dc.description.abstractУ циљу употребе у биосензорима и биогоривним ћелијама, успостављена је производња растворних облика целобиоза дехидрогеназе (CDH) претходно еволуираних на површини квашчевих ћелија S. cerevisiae. У ту сврху су мутанти CDH, tm (D20N, A64T, V592M), H5 (D20N, V22A, A64T, V592M) и H9 (D20N, A64T, T84A, A261P, V592M, E674G, N715S) клонирани у pPICZα плазмид и трансформисани у Pichia pastoris KM71H сој за високу експресију у растворном облику и кинетичку карактеризацију. После 6 дана експресије под индукцијом метанолом, мутанти су пречишћени ултрафилтрацијом, јоноизмењивачком хроматографијом и гел-филтрацијом. SDS електрофореза је потврдила чистоћу уз присуство једне протеинске траке молекулскe масe од 100 kDa. Кинетичка карактеризација је показала да H5 мутирани протеин поседује највећу каталитичку константу од 43,5 s-1 за лактозу, док је H9 имао највећу константу специфичности за лактозу од 132 mM-1 s-1. Сва три мутирана протеина су имала неизмењен pH оптимум који је био у опсегу од 4,5 до 5,5. У поређењу са претходно добијеним природним и мутантним облицима CDH протеина из Phanerochaete chrysosporium, облици приказани у овом раду имају већу активност и специфичност, што их, повезано са високом експресијом протеина у P. Pastoris, чини добрим кандидатима за упо- требу у биотехнологији за производњу лактобионске киселине и биосензора.sr
dc.language.isoensr
dc.publisherBelgrade : Serbian Chemical Societysr
dc.relationinfo:eu-repo/grantAgreement/MESTD/Basic Research (BR or ON)/172049/RS//sr
dc.relationinfo:eu-repo/grantAgreement/MESTD/Basic Research (BR or ON)/173017/RS//sr
dc.relationinfo:eu-repo/grantAgreement/MESTD/Integrated and Interdisciplinary Research (IIR or III)/46010/RS//sr
dc.rightsopenAccesssr
dc.rights.urihttps://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
dc.sourceJournal of the Serbian Chemical Societysr
dc.subjectmutant proteinssr
dc.subjectyeastsr
dc.subjectprotein purificationsr
dc.subjectkinetic characterisationsr
dc.titleExpression, purification and characterization of cellobiose dehydrogenase mutants from Phanerochaete chrysosporium in Pichia pastoris KM71H strainen
dc.titleEkspresija, prečišćavanje i karakterizacija mutanata celobioza - dehidrogenaze iz Phanerochaete chrysosporium u Pichia pastoris KM71H sojusr
dc.typearticlesr
dc.rights.licenseBY-NC-NDsr
dcterms.abstractОстафе, Ралуца; Фисцхер, Раинер; Продановић, Радивоје; Продановић, Оливера; Поповић, Николина; Балаж, Aна Марија; Блажић, Марија;
dc.citation.volume85
dc.citation.issue1
dc.citation.spage25
dc.citation.epage35
dc.citation.rankM23~
dc.identifier.doi10.2298/JSC190320058B
dc.identifier.fulltexthttp://cer.ihtm.bg.ac.rs/bitstream/id/18021/0352-51391900058B.pdf
dc.identifier.scopus2-s2.0-85094195269
dc.identifier.wos000514217400003
dc.type.versionpublishedVersionsr


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record