Primena rastvornih i imobilizovanih izoformi peroksidaze iz rena u uklanjanju obojenih ksenobiotika iz otpadne vode

Abstract

Intenzivan industrijski razvoj propraćen je sve većom kompleksnošću sastava otpadnihvoda. Sintetičke boje su danas u širokoj primeni u velikom broju industrijskih grana. Većinaboja poseduje kompleksnu hemijsku strukturu, kao i povećanu hemijsku stabilnost što ih nakonotpuštanja u vodotokove čini ksenobioticima koji najčešće ispoljavaju i svoje rekalcitrantneosobine. Potreba za novim tehnološkim rešenjima radi uklanjanja širokog spektra ovihobojenih ksenobiotika dovela je do opsežnog istraživanja na ovom polju, dok je u poslednjihnekoliko godina istraživanje na polju primene enzima veoma uznapredovalo.Ova disertacija se bavi izolovanjem kiselih i baznih izoformi peroksidaze iz rena injihovom primenom u uklanjanju različitih obojenih ksenobiotika, optimizacijom reakcijeobezbojavanja, praćenjem i analizom proizvoda zaostalih nakon enzimske degradacije,sintezom imobilizata sa povećanom stabilnošću i efikasnošću u uklanjanju širokog spektraobojenih ksenobiotika. Cilj je bio razvijanje efikasne metode za uklanjanje i detoksifikacijuotpadne vode zaostale nakon procesa bojenja.Izolovanje i prečišćavanje kiselih, baznih i neutralnih izoformi peroksidaze iz renaurađeno je jonoizmenjivačkom hromatografijom na QAE-Sephadex koloni. Razdvojeneizoforme detektovane su zimogramskom detekcijom, nakon izoelektričnog fokusiranja.Optimizovani su uslovi reakcije obezbojavanja primenom rastvornih enzimskih preparata (0,14U mL-1 enzima i 0,44 mM vodonik-peroksida). Testirano je obezbojavanje 24 boje različitihstruktura i karakteristika u zavisnosti od pH i izoforme peroksidaze iz rena. Najveći stepenobezbojavanja postignut je u slučaju 17 boja sa primenom kisele izoforme peroksidaze iz rena:šest pripada klasi azo boja, tri boje triarilmetanskoj i jedna boja tiazinskoj klasi boja dok supreostalih 7 zaštićenih struktura nedostupnih za javnost. U slučaju 12 boja najboljeobezbojavanje postignuto je na pH 5, a u slučaju 10 boja na pH 9. Obezbojavanje je praćenoUV-Vis spektrofotometrijom, a degradacija je potvrđena analizom na HPLC-u.Obezbojavanjem model-boje (оranž II) kiselom izoformom peroksidaze iz rena dobijeniglavnih proizvodi obezbojavanja identifikovani su LC–ESI-ToF-MS tehnikom.Kisela izoforma peroksidaze iz rena uspešno je imobilizovana na 10 komercijalnodostupnih i laboratorijski sintetisanih nosača primenom različitih imobilizacionih tehnika.Kisela izoforma peroksidaze iz rena imobilizovana na hitozanu pokazala je najveću specifičnugvajakolnu aktivnost (2080 U g-1) kao i dekolorizacionu aktivnost uklanjanjem 175 mg L-1model boje. Dobijeni imobilizat pokazao je veću stabilnost prema vodonik-peroksidu upoređenju sa slobodnim enzimom. Imobilizat je pokazao i dobru operativnu stabilnost pa senjegova dekolorizaciona aktivnost nakon 7 ponovljenih ciklusa smanjila za samo 35%.Procena toksičnosti boja i proizvoda obezbojavanja ispitana je na Artemia salina.Obezbojavanje model-boja dovelo je do smanjenja % mortaliteta larvi A. salina u odnosu napočetni rastvor. Ekogenotoksičnost 8 model-boja testirana je na BEAS-2B ćelijama osnovnimi modifikovanim komet testom. Detektovani stepen oštećenja DNA iznosio je od 5 do 47%. Uslučaju model-boje, oranž II detektovana su oksidativna oštećenja pri izlaganju ćelija rastvoruboje (300 μg mL-1), dok izlaganje proizvodima degradacije nakon enzimskog tretmana sakiselom izoformom peroksidaze iz rena ne dovodi do istog efekta.Ispitane su interakcije boja i proizvoda degradacije sa DNA iz telećeg timusa iplazmidnom DNA na model boji oranž II i amido crno 10b primenom UV–Vis i fluorescentnespektrometrije i agaroznom elektroforezom. Nije uočeno značajno cepanje plazmidnogmolekula DNA nakon izlaganja rastvorima boja pre i nakon enzimskog obezbojavanja.

Intense industrial development has been accompanied by higher complexity ofeffluents. Synthetic dyes have been widely used in great number of industrial sectors.Majority of dyes possesses complex chemical structures, as well as chemical stability,which makes them persistent xenobiotics after their release in water bodies. The need fornew technological solutions for removal of these colored xenobiotics has led to majorongoing research on this field with big emphasis on enzyme application.Subject of this doctoral dissertation is isolation and application of acidic and basichorseradish peroxidase isoforms in decolorization of various colored xenobiotics,optimization of decolorization reactions, monitoring and analysis of decolorizationproducts, synthesis of immobilizates with higher stability and efficiency in removal ofwide spectrum of colored xenobiotics in order to develop efficient method for removaland detoxification of wastewater after the coloring process.Acidic isoforms have been purified from basic and neutral horseradish isoformsusing ion exchange chromatography on QAE-Sephadex column. Separated isoformshave been detected by zymograms after the isoelectric focusing. Decolorization reactionhas been optimized using soluble enzyme isoforms (0.14 U mL-1 and 0.44 mM hydrogenperoxide). Decolorization of 24 dyes of various structures and characteristics have beentested depending of pH and peroxidase isoforms. In case of 17 dyes highestdecolorization has been achieved using acidic horseradish peroxidase: six dyes are fromazo, three from triarylmethane and one from thiazine category while the rest of dyes havestructure which is unavailable to the public. Twelve dyes were decolorized best at pH 5,while 10 dyes were decolorized best at pH 9. Decolorization was monitored by UV–Visspectrometry, while degradation was confirmed by HPLC. By decolorization of modeldye (orange II) using acidic horseradish peroxidase the main decolorization productswere identified by LC–ESI-ToF-MS technique.Acidic isoform has been successfully immobilized on 10 commercially availableand laboratory synthetized carriers by various immobilization techniques. Acidichorseradish isoform immobilized on chitosan has shown highest specific activity towardguaiacol (2080 U g-1) as well as decolorization acvitity by removal of 175 mg L-1 ofmodel dye. The immobilizate obtained showed higher stability towards hydrogenperoxide in comparison with the soluble enzyme. The immobilizate has shown goodoperative stability since it has retained 65% of its decolorization activity after 7 repeatedcycles. The assessment of toxicity of dyes and decolorization products has been testedon Artemia salina. Decolorization of model dye has resulted in reduction of mortality ofA. salina larvae in comparison with initial dye. Ecogenotoxcitiy of 8 model dyes has beentested on BEAS-2B cells using basic and modified comet assay. DNA damage detectedwas from 5 to 47%. In case of model dye, orange II, oxidative DNA damage has beendetected after the exposure of cells to dye solutions (300 μg mL-1), while degradationproducts after enzymatic decolorization with acidic horseradish peroxidase showed noDNA damage.Interactions of dyes and degradation products with DNA from calf thymus andplasmid DNA has been studied using model dye orange II and amido black 10b by UV–Vis and fluorescent spectroscopy and agarose electrophoresis. Significant DNA strandbreaks on plasmid DNA has not been detected in either case.